基因工程（第二版）

《基因工程》第二版為國家精品課程建設教材、國家精品資源分享課教材，與教材配套有慕課視頻可供學習。

本教材主要內容包括三部分：一是基因工程的基本原理與基本技術，涉及工具酶和基因工程載體及常用的基因表達系統，目的基因獲取、製備、擴增、導入與鑒定的各種方法。二是基因工程用於功能基因組學研究的技術，包括基因表達譜研究技術、全基因 組化學誘變和轉座子飽和誘變技術、基因敲除與基因敲減技術、過表達和異位表達技術、染色質沉澱等基因相互作用研究技術等，第二版還大篇幅增加了TALEN和CRISPR基因編輯技術的發展歷史和進展。三是基因工程在工農業生產和醫學研究中的應用，包括轉基因植物、轉基因動物的製備與應用，轉基因安全評價與監管，基因治療的原理、策略與研究進展。

本教材可用作國內高等院校及科研院所生物科學、生物技術、生物工程及基礎醫學和製藥專業的本科生、研究生及科研人員學習的教材和參考書，也可作為對轉基因技術和基因工程感興趣的其他領域人士科普學習的參考書。

1基因工程概述/001
1.1基因工程的概念與基本流程/001
1.1.1基因工程的概念/001
1.1.2基因工程的基本流程/002
1.2基因工程的發展簡史/003
1.2.1基因工程誕生的背景/003
1.2.2基因工程的誕生/004
1.2.3基因工程的發展/006
1.3基因工程的研究意義和應用/007
1.3.1基因工程在功能基因組學研究中的應用/007
1.3.2基因工程在工業領域的應用/008
1.3.3基因工程在農業領域的應用/009
1.3.4基因工程在醫藥領域的應用/011
本章小結/013
複習題/013

2基因工程工具酶/014
2.1限制性核酸內切酶/014
2.1.1限制性核酸內切酶的發現和種類/014
2.1.2限制性核酸內切酶的命名/016
2.1.3限制性核酸內切酶的特徵/016
2.1.4限制性核酸內切酶的同尾酶/018
2.1.5影響限制性核酸內切酶酶切反應的因素/020
2.1.6限制性核酸內切酶酶切位點的引入與消失/022
2.2DNA連接酶/023
2.2.1DNA連接酶的作用/023
2.2.2不同末端的連接策略/025
2.2.3影響DNA連接反應的因素/027
2.3DNA聚合酶類/029
2.3.1大腸桿菌DNA聚合酶/029
2.3.2Klenow大片段酶/030
2.3.3耐熱的DNA聚合酶Taq/030
2.3.4T4噬菌體DNA聚合酶/031
2.3.5逆轉錄酶/032
2.4鹼性磷酸酶/033
2.4.1鹼性磷酸酶防止載體自連/033
2.4.2獲得5′末端磷酸基團標記的探針/036
2.5末端去氧核苷酸轉移酶/036
2.6其他工具酶/037
2.6.1s型限制性核酸酶/038
2.6.2Cas核酸內切酶/039
2.6.3Dicer酶/039
2.6.4重組酶/040
本章小結/043
複習題/043

3基因工程載體/044
3.1克隆載體/044
3.1.1質粒載體/045
3.1.2噬菌體載體/053
3.1.3黏粒載體/057
3.1.4人工微小染色體/058
3.2表達載體/060
3.2.1原核表達載體/060
3.2.2真核表達載體/072
本章小結/076
複習題/076

4目的基因的獲取與製備/077
4.1從基因文庫獲取目的基因/078
4.1.1基因組文庫的構建與篩選/078
4.1.2cDNA基因文庫的構建與篩選/083
4.2電子克隆法獲取目的基因/092
4.2.1利用EST資料庫進行電子克隆/093
4.2.2利用基因組資料庫進行電子克隆/093
4.2.3全長cDNA的判斷/094
4.2.4電子克隆基因的生物資訊學分析/095
4.3PCR獲取與擴增目的基因/095
4.3.1常規PCR/095
4.3.2反向PCR/102
4.3.3反轉錄PCR/104
4.3.4即時螢光定量PCR/105
4.3.5多重PCR/110
4.3.6巢式PCR/113
4.3.7不對稱PCR/113
4.3.8RACEPCR/114
4.3.9原位PCR/114
4.4通過蛋白質工程改建目的基因/116
4.4.1蛋白質工程的概念/116
4.4.2蛋白質工程的定點突變技術/117
4.4.3蛋白質工程的定向進化技術/121
本章小結/123
複習題/124

5目的基因導入受體細胞的方法/125
5.1把目的基因導入大腸桿菌/126
5.1.1自然條件下的轉化過程/126
5.1.2感受態受體細胞的選擇/128
5.1.3外源目的基因轉化進入大腸桿菌細胞的方法/129
5.1.4外源基因通過噬菌體轉導進入受體細胞/131
5.2把目的基因導入酵母細胞/133
5.2.1聚乙二醇介導的酵母轉化/133
5.2.2金屬陽離子介導的酵母轉化/134
5.3把目的基因導入植物細胞/134
5.3.1DNA直接轉移法/135
5.3.2農桿菌Ti質粒載體介導法/137
5.4把目的基因導入動物細胞/141
5.4.1外源基因導入離體培養的動物細胞/142
5.4.2外源基因導入在體動物細胞/144
本章小結/147
複習題/147

6陽性轉化子的鑒定/148
6.1遺傳表型檢測法/148
6.1.1利用載體提供的表型特徵篩選和鑒定重組DNA分子/149
6.1.2利用外源目的基因本身的序列提供的表型特徵篩選/153
6.2酶切電泳檢測/155
6.2.1凝膠電泳檢測篩選/155
6.2.2限制性核酸內切酶酶切分析篩選/156
6.3核酸分子雜交/158
6.3.1Southern印跡雜交/159
6.3.2Northern印跡雜交/164
6.3.3蛋白質印跡分析/167
6.4PCR擴增鑒定篩選/168
6.5DNA序列測定/169
6.5.1Sanger雙去氧末端終止法/169
6.5.2化學降解法/171
6.5.3自動測序法/172
6.5.4二代測序技術/173
6.5.5三代測序技術/176
6.5.6單細胞測序技術/179
6.5.7高通量測序在組學研究中的應用/180
本章小結/184
複習題/184

7基因工程在基因功能研究中的應用/185
7.1基因的表達譜研究技術/185
7.1.1胚胎原位雜交技術/186
7.1.2胚胎抗體染色技術/190
7.1.3基因晶片技術/194
7.2基因的突變研究技術/199
7.2.1化學誘變/199
7.2.2轉座子全基因組誘變/200
7.3基因敲除技術/204
7.3.1完全基因敲除技術/204
7.3.2條件基因敲除技術/209
7.4基因編輯技術/214
7.4.1鋅指核酶基因敲除技術/215
7.4.2TALEN基因編輯技術/218
7.4.3CRISPR基因編輯技術/221
7.5基因敲減技術/241
7.5.1RNA干擾技術/241
7.5.2Morpholino干擾技術/244
7.6基因過表達與異位表達技術/246
7.6.1GAL4/UAS系統的構建/247
7.6.2GAL4/UAS定時開啟系統/248
7.7基因的相互作用研究技術/249
7.7.1凝膠遷移率阻滯技術/250
7.7.2染色質免疫沉澱技術/250
7.7.3酵母雙雜交技術/253
7.7.4免疫共沉澱技術/256
本章小結/257
複習題/258

8轉基因植物/259
8.1轉基因植物研究和生產現狀/260
8.1.1轉基因植物的研究概況/260
8.1.2抗除草劑轉基因作物/261
8.1.3抗蟲轉基因作物/263
8.1.4提高作物產量和品質的轉基因作物/266
8.1.5其他轉基因作物/268
8.1.6植物生物反應器/273
8.2轉基因植物的篩選與檢測/275
8.2.1報告基因/275
8.2.2分子生物學檢測方法/277
8.3轉基因植物的安全性/278
8.3.1轉基因安全性的由來/279
8.3.2轉基因安全性的爭論/279
8.3.3轉基因作物安全性評價程式/284
8.3.4轉基因作物安全性的監管/285
本章小結/287
複習題/287

9轉基因動物/288
9.1動物轉基因技術/289
9.1.1顯微注射法/289
9.1.2逆轉錄病毒感染法/294
9.1.3胚胎幹細胞介導法/297
9.1.4體細胞核移植法/299
9.2轉基因動物的篩選與檢測/305
9.2.1報告基因/305
9.2.2分子生物學檢測方法/306
9.2.3轉基因動物整體表型的觀察/309
9.3轉基因動物的現狀與應用/309
9.3.1轉基因動物的現狀/309
9.3.2轉基因動物在基因功能研究中的應用/310
9.3.3轉基因技術在動物育種中的應用/311
9.3.4轉基因動物在醫學研究中的應用/313
9.3.5動物生物反應器/314
本章小結/318
複習題/318

10基因治療/319
10.1基因治療的概念與策略/319
10.1.1基因治療的途徑與策略/320
10.1.2基因治療的基本程式/321
10.1.3基因治療的發展、現狀與問題/323
10.2基因治療的載體/328
10.2.1逆轉錄病毒載體/328
10.2.2腺病毒載體/329
10.2.3腺相關病毒載體/332
10.2.4單純皰疹病毒載體/333
10.2.5非病毒載體/335
10.3重要疾病的基因治療/336
10.3.1遺傳病的基因治療/336
10.3.2腫瘤的基因治療/342
10.3.3愛滋病的基因治療/358
本章小結/367
複習題/367
參考書目與文獻/368

袁婺洲，湖南師範大學生命科學院教授，博士生導師。
 
1988年畢業於北京師範大學生物學系，1994年獲湖南農業大學遺傳學專業博士學位。美國密西根大學博士後，英國倫敦大學學院高級研究學者。自1994年起在湖南師範大學生命科學學院從事《基因工程》和《遺傳學》等課程的教學工作。
 
主持《基因工程》國家精品課程及國家精品資源分享課程各1項，湖南省精品線上開放課程1項。主編教材2部，合編教材3部。獲“第11屆全國多媒體課件大賽”二等獎1項，湖南師範大學教學成果一等獎2項，教學獎5項。

主編的《基因工程》教材獲2012年中國石油和化學工業出版物獎（教材獎）二等獎。研究方向是利用動物模型研究人類心臟發育及心血管疾病基因的功能與調控機制。主持國家自然科學基金項目5項、教育部新世紀人才支持計畫1項及省級課題多項。在國內外雜誌發表研究論文120多篇，合作出版專著4部。獲湖南省科技進步一等獎1項、湖南省自然科學獎一等獎1項、第五屆湖南省青年科技獎1項、湖南省“芙蓉百崗明星”1項。